رنگ آمیزی گرم

رنگ آمیزی گرم از متداول ترین روش­ های رنگ آمیزی در علم میکروبیولوژی به شمار می ­رود.سکوبندی ازمایشگاهی  این روش برای تشخیص باکتری گرم مثبت و گرم منفی، بررسی اندازه و اشکال باکتری­ ها و همچنین بررسی مشخصات ظاهری باکتری ها بسیار مورد استفاده قرار می گیرد. در واقع اساس این رنگ آمیزی ساختمان دیواره باکتری ها است. برای این منظور از 4 محلول کریستال ویوله، لوگول، عامل رنگ بر و سافرانین طی 4 مرحله پس از تهیه گسترش، خشک کردن و فیکس کردن استفاده می شوند.

این مقاله صفر تا صد آزمایش رنگ آمیزی گرم را همراه با دستگاه ها و تجهیزات مورد نظر شرح می دهد.

رنگ های مناسب برای مشاهده اجزاء سلولی

برای این منظور اغلب از رنگ های دارای بار مثبت (ماهیت بازی یا کاتیونیک) مانند کریستال ویوله، سافرانین، مالاشیت گرین و متیلن بلو استفاده می شود. همان طور که گفته شد این رنگ ها دارای بار مثبت می باشند و به اجزای سلولی با بار منفی جذب می شوند. به هنوان مثال دیواره باکتری که دارای بار منفی است.

مراحلی که قبل از رنگ آمیزی گرم باید انجام شوند

قبل از شروع به انجام آزمایش تمام تجهیزات را با استفاده از اتوکلاو استریل کنید.

برای آزمایش رنگ آمیزی گرم به ترتیب باید مراحل زیر در آزمایشگاه های میکروبیولوژی انجام شوند:

1. تهیه گسترش: ابتدا یک قطره سرم فیزیولوژی در قسمت میانی لام بریزید. سپس با استفاده از لوپ استریل کلنی باکتری از محیط کشت حاوی باکتری که در انکوباتور نگه داشته شده بود برداشته و در قطره روی لام حل کنید. این محلول را بر روی لام طوری پخش کنید که نه گسترش بسیار نازک باشد و نه متراکم.
2. خشک کردن: مدتی صبر کرده تا گسترش تهیه شده در دمای محیط آزمایشگاه خشک شود.
3. فیکس کردن: گسترش تهیه شده را 4 مرتبه به صورت رفت و برگشتی و با فاصله مناسب از شعله از روی شعله چراغ بونزن عبور دهید تا گسترش فیکس شود.

اکنون گسترش آماده رنگ آمیزی گرم است.

مراحل رنگ آمیزی گرم

1. در ابتدا  بر روی لام آماده شده چند قطره کریستال ویوله بریزید. پس از گذشت 1 دقیقه لام را با زاویه 45 درجه بر روی تشتک رنگ آمیزی قرار دهید و با آب مقطر شستشو دهید. صبر کنید تا خشک شود. کریستال ویوله باعث می شود که کلیه باکتری های گسترش رنگ بنفش به خود بگیرند.
2. در مرحله دوم رنگ آمیزی گرم چند قطره از محلول لوگول (ترکیبی از ید و یدور پتاسیم) بر روی لام بریزید. 1 دقیقه زمان بگیرید و پس از آن لام را با آب مقطر شستشو دهید. لوگول باعث تثبیت رنگ اولیه ( کریستال ویوله ) و همچنین تشکیل کمپلکس کریستال ویوله-ید می شود.
3. همانند قبل لام را با زاویه 45 درجه گرفته و بر روی آن چند قطره محلول رنگ بر ( مخلوط الکل-استن) بربزید. پس از گذشت 10 تا 20 ثانیه لام را به وسیله آب مقطر شستشو دهید.
4. تفاوت باکتری های گرم مثبت و گرم منفی در ساختار دیواره آن ها می باشد. در ساختار دیواره باکتری های گرم منفی نسبت به باکتری های گرم مثبت چربی بیش تری وجود دارد. به همین دلیل محلول رنگ بر که حلال چربی است، چربی های باکتری را در الکل-استن حل می کند. درواقع علاوه بر خارج شدن چربی ها باعث خارج شدن و شسته شدن کریستال ویوله از سطح باکتری گرم منفی نیز می شود.
5. در مرحله آخر رنگ زمینه سافرانین را بر روی لام بریزید.  برای بار آخر پس از گذشت 1 دقیقه لام را با آب مقطر به صورت آهسته شستشو دهید. سافرانین باعث می شود باکتری های گرم منفی به رنگ قرمز درآیند اما باکتری های گرم مثبت این رنگ را به خود جذب نکرده و همچنان به رنگ بنفش دیده می شوند.

مشاهده باکتری زیر میکروسکوپ

پس از انجام مراحل آزمایش رنگ آمیزی گرم، می توانید نتایج را با یک میکروسکوپ بررسی کنید.

میکروسکوپ را به پریز برق وصل کنید. سپس بر روی لام رنگ آمیزی شده یک قطره روغن ایمرسیون ریخته و لام را بر روی میکروسکوپ قرار دهید. بزرگنمایی میکروسکوپ را بر روی 100 تنظیم کنید. اکنون می توانید پس از تنظیم عدسی های چشمی باکتری های گرم منفی را به رنگ قرمز و باکتری های گرم مثبت را به رنگ بنفش زیر میکروسکوپ مشاهده کنید.